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大黄素的药理作用之抗炎篇

文章出处:www.scglp.com 人气:发表时间:2018-09-19 16:39
【简述】
大黄素(3-甲基-1,6,8-三羟基蒽醌)是存在于掌叶大黄根和根茎中的活性成分之一。它已被证明含有多种作用(抗肿瘤,抗菌,利尿和血管舒张作用)。然而,大黄素的抗炎作用目前还没有被证实。在这里,我们通过研究了大黄素对小鼠编号,看看大黄素是否真的存在抗炎作用。
大黄素实拍图
【实验材料】
本次实验,我们总共选取了50只患有关节炎的雄性小鼠。将小鼠圈养在具有12小时光照/黑暗循环的层流柜中,并随意维持在标准实验室饲料中。所使用的大黄素来自成都格利普生物科技所生产(四川省成都市温江区)。

【步骤】
1.破骨细胞分化
通过用α最小必需培养基冲洗长骨分离来自5周龄ICR小鼠的骨髓细胞,然后将细胞悬浮于补充有10%胎牛血清中;将细胞培养过夜。收集非贴壁细胞,在M-CSF的环境存在下培养3天。移除漂浮细胞并将贴壁细胞用作骨髓衍生的巨噬细胞。以3.5×10 4播种将细胞/孔置于48孔板中,并在存在或不存在大黄素的情况下用M-CSF和NF-κB配体的受体活化剂培养4天。通过染色抗酒石酸酸性磷酸酶活性来观察破骨细胞。将阳性细胞计数为破骨细胞。

2.注射大黄素
用等体积的完全弗氏佐剂乳化的150μg牛II型胶原给小鼠注射。第一次注射的当天定义为第0天。然后在第21天的时候用等量的在弗氏不完全佐剂中乳化的牛II型胶原注射小鼠,并在腹膜内注射脂多糖(30μg)。在每个实验中使用两组动物:一组动物在初次注射后第25至35天之间每隔一天腹膜内注射10mg / kg大黄素;另一组关节炎小鼠注射PBS代替大黄素。

接着,我们就可以对每一只小鼠的关节发炎程度评分,评分为0-3级:0级,无肿胀; 1级,轻微肿胀和红斑; 2级,明显肿胀; 3级,严重肿胀和/或关节僵硬。用最宽点处穿过踝关节放置的电动卡尺测量后爪厚度。将特定时间点的关节炎踝直径的增加与第0天的直径相比定义为爪厚度指数,并且该值以百分比表示。在第45天,杀死小鼠并从每只小鼠中提取滑膜组织。

3.细胞因子分析
为了确定患病小鼠的细胞因子水平,在第45天获得血清和踝关节组织。通过在裂解缓冲液(组织蛋白提取试剂)中均质化关节从踝关节分离蛋白质提取物。。使用试剂盒测量血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平。

4.制备细胞质和核蛋白质提取物
关节组织通过离心操作后在PBS中洗涤两次,然后沉淀5分钟。用蛋白酶和磷酸酶抑制剂匀浆组织。使用NE-PER核和细胞质提取试剂从组织制备细胞质和核提取物。

5.电泳迁移率变动分析
将由关节组织制备的核提取物与蛋白酶抑制剂混合物一起温育以抑制内源性蛋白酶活性。合成对应于NF-κB位点的寡核苷酸,将两条互补链退火并用[α- 32标记]。标记的寡核苷酸,10μg核提取物和结合缓冲液在室温下孵育30分钟,最终体积为20μl。接下来,通过在0.5%硼酸盐缓冲液中的4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳来分析反应混合物。将凝胶干燥并通过放射自显影检查。通过使用50倍过量的未标记寡核苷酸的竞争测定证实了蛋白质-DNA相互作用对NF-κB的特异性。

6.蛋白质印迹分析
在蛋白质提取溶液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂将关节组织匀浆。含有30μg蛋白质的匀浆通过10%SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用1μg/ ml针对增殖细胞核抗原,β-肌动蛋白,探测印迹。。过氧化物酶缀合的抗兔或抗小鼠IgG用作二抗。

7.组织病理学评估
将关节​​组织用10%福尔马林固定,在10%EDTA中脱钙3周,脱水并包埋在石蜡中。将切片(6μm)用苏木精和曙红(H&E)或番红O染色用于光学显微镜检查。对关节切片的滑膜增殖,炎症,软骨损伤和骨侵蚀的变化进行评分,每个评分为0-4。为了研究具有CIA的小鼠中的破骨细胞骨吸收活性,将切片用TRAP染色试剂盒染色。在每个踝的10个区域(200×放大倍数)中计数含有三个或更多个细胞核的TRAP阳性多核细胞的总数。

8.射线照相评估
使用基于直接检测平板阵列设计的X线照相成像仪,使用30kVp和90mA的曝光设置,获得爪的平片。关节破坏程度和骨侵蚀评分为0-5:0,无损伤; 1,在一个开悟的部位观察到轻微的骨质破坏; 2,适度变化,一个区域有两到四个斑点; 3,在多个区域内有两到四个斑点的显着变化; 4,严重糜烂折磨关节; 5,完全破坏关节。

 
9.统计分析
数据表示为平均值± SEM。使用单因素方差分析进行统计学比较,然后进行事后分析。

【结果】
为了评价大黄素对小鼠的抗炎的作用,我们用CFA中的牛CII免疫小鼠,然后在初次免疫后第21天用IFA中的CII加强免疫。PBS处理的小鼠具有增加的疾病发病率并且发展出后爪的严重肿胀,红斑和关节僵硬。相反,在用大黄素的小鼠中,CIA的发病率和严重程度显着减弱。与PBS处理的小鼠相比,具有确定的关节炎临床症状的小鼠的大黄素导致CIA的发病率和严重性逐渐降低,如通过临床评分和爪肿胀所评估的。各组之间的体重变化没有明显差异。接下来,我们通过放射线照相证实了整个踝部区域的关节破坏。PBS处理的小鼠的后爪的射线照相显示CIA的典型变化,关节破坏,关节移位和覆盖整个踝区的不规则骨增生。然而,后爪的放射照相结果和平均放射学评分显示大黄素处理的小鼠中的骨破坏明显较少。组织病理学评估显示踝关节的滑膜增生,软骨损伤,炎性细胞浸润和骨侵蚀。来自大黄素处理的小鼠的踝关节显示出比PBS处理的小鼠显着更少的炎症和关节破坏。
 

【结论】
在这里已经表明,大黄素的确具有抗炎的作用,通过腹膜内注射大黄素,抑制了NF-κB的途径在小鼠体内发挥抗炎作用,就能够抑制小鼠的炎症反应,并且大黄素还可能具有抵抗关节破坏的价值作用。
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